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守護(hù)用藥安全：皖儀高效液相色譜法精準(zhǔn)檢測富馬酸比索洛爾片中的亞硝胺雜質(zhì)

方案概述

前言：

亞硝胺雜質(zhì)是一類具有亞硝基與胺結(jié)合（R1N(-R2)-N=O）的化學(xué)結(jié)構(gòu)的化合物，具有高潛在致突變致癌性。自華海纈沙坦事件以來，多種藥品中相繼檢出小分子亞硝胺類雜質(zhì)（如NDMA、NDEA、NDBA等）或與原料藥相關(guān)的亞硝胺類雜質(zhì)，使得監(jiān)管機(jī)構(gòu)和制藥企業(yè)對該類雜質(zhì)一直高度關(guān)注。富馬酸比索洛爾片的主要成份為富馬酸比索洛爾，其化學(xué)名稱為：1-[4-[[2-（1-甲基乙氧基）乙氧基]甲基]-苯氧基]-3-[（1-甲基乙基）胺基]-2-丙醇富馬酸鹽，分子式為（C₁₈H₃₁NO₄)₂·C₄H₄O₄。其主要適應(yīng)癥為高血壓．冠心?。ㄐ慕g痛）。伴有心室收縮功能減退（射血分?jǐn)?shù)≤35%，根據(jù)超聲心動圖確定）的中度至重度慢性穩(wěn)定性心力衰竭。在使用本品前，需要遵醫(yī)囑接受ACE抑制劑、利尿劑和選擇性使用強(qiáng)心甙類藥物治療。比索洛爾因結(jié)構(gòu)中含有仲胺，可能會產(chǎn)生相應(yīng)的亞硝胺（NDSRI）雜質(zhì)，其亞硝胺雜質(zhì)N-亞硝基-比索洛爾結(jié)構(gòu)如下圖1，根據(jù)FDA發(fā)布的亞硝胺原料藥相關(guān)雜質(zhì)推薦可接受攝入量控制指南中記載N-亞硝基-比索洛爾AI（允許攝入量，Acceptable Intake）值為1500ng/天。

圖1 比索洛爾及其N-亞硝基-比索洛爾結(jié)構(gòu)圖

N-亞硝基-比索洛爾AI值為1500ng/天，結(jié)合富馬酸比索洛爾片已批準(zhǔn)說明書規(guī)定的最大日劑量10mg/天計(jì)算，控制限度為150ppm。結(jié)合限度，開發(fā)了高效液相色譜法對富馬酸比索洛爾片中的亞硝胺雜質(zhì)N-亞硝基-比索洛爾進(jìn)行測定，并且對方法采用皖儀科技高效液相色譜儀LC3400系列配置紫外檢測器進(jìn)行相應(yīng)的方法學(xué)驗(yàn)證，包括：專屬性、線性、準(zhǔn)確度、重復(fù)性、檢測限等，結(jié)果顯示該方法專屬、靈敏。

關(guān)鍵詞：比索洛爾；高效液相色譜法；亞硝胺雜質(zhì)

1.儀器設(shè)備及試劑

1.1液相配置清單

表1 高效液相色譜系統(tǒng)配置清單

序號	名稱	數(shù)量
1	UV3400 紫外檢測器	1臺
2	P3400B 二元高壓恒流泵	1臺
3	CT3400 柱溫箱	1臺
4	AS3400 全自動進(jìn)樣器	1臺
5	SmartLab NetCDS 色譜使用工作站	1套
6	C18 250x4.6 mm，5 μm	1個

1.2試劑及標(biāo)準(zhǔn)品清單

表2 試劑及標(biāo)品清單表

序列	試劑及對照品	純度
1	乙腈	HPLC級
2	磷酸二氫銨	AR級
3	磷酸	AR級
4	N-亞硝基-比索洛爾對照品	99.4%

1.3實(shí)驗(yàn)材料及輔助設(shè)備

超聲波清洗機(jī)；

渦旋混合器

2.實(shí)驗(yàn)方法

2.1溶液配制

2.1.1 磷酸鹽緩沖液：稱磷酸二氫銨3.45g，加水900mL，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.5，加水稀釋至1000mL。

2.1.2 溶劑：磷酸鹽緩沖液：乙腈=(85:15)。

2.1.3 線性溶液：取N-亞硝基-比索洛爾對照品適量，精密稱定加流動相溶解并稀釋至每1mL約含1000ng的溶液，作為標(biāo)準(zhǔn)貯備液母液；精密量取標(biāo)準(zhǔn)貯備液適量，加流動相定容至刻度線，搖勻，配制成濃度為15ng/mL、20ng/mL、30ng/mL、40ng/mL、60ng/mL、100 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)系列線性溶液。

2.1.4對照品溶液：取N-亞硝基-比索洛爾對照品適量，精密稱定，用流動相溶解并稀釋制成每1mL約含N-亞硝基-比索洛爾30ng的溶液，作為對照品溶液。

2.2樣品配制

2.2.1 樣品溶液

精密稱取富馬酸比索洛爾細(xì)粉（約相當(dāng)于比索洛爾5mg）適量，置25mL量瓶中，用流動相溶解并稀釋制成每1mL約含比索洛爾0.2mg的溶液，作為樣品溶液。用濾膜過濾后上機(jī)。

2.2.2 準(zhǔn)確度溶液

精密稱取富馬酸比索洛爾細(xì)粉（約相當(dāng)于比索洛爾5mg）適量，置25mL量瓶中，加入適量的N-亞硝基-比索洛爾對照品溶液，用流動相溶解并稀釋至刻度，配制成100%加標(biāo)樣品，搖勻，即得，作為準(zhǔn)確度溶液。用濾膜過濾后上機(jī)。

3實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1專屬性

圖2 專屬性測試譜圖

說明：溶劑不干擾N-亞硝基-比索洛爾檢測，供試品溶液中其他雜質(zhì)色譜峰亦不干擾N-亞硝基-比索洛爾雜質(zhì)測定。

3.2線性測試

圖3 N-亞硝基-比索洛爾雜質(zhì)測試色譜疊加圖

圖4 N-亞硝基-比索洛爾雜質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

說明：實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，N-亞硝基-比索洛爾雜質(zhì)測試線性相關(guān)系數(shù)R值在0.9999以上，滿足試驗(yàn)要求。

3.3 重復(fù)性測試

圖5 6針30ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品重復(fù)性測試譜圖

表3 6針30ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品重復(fù)性測試數(shù)據(jù)

化合物名	保留時間（min）
N-亞硝基-比索洛爾	13.958
	13.963
	13.968
	13.973
	13.966
	13.948
平均值	13.963
RSD（%）	0.063

說明：由上表數(shù)據(jù)可知，N-亞硝基-比索洛爾保留時間重復(fù)性為0.063%，重復(fù)性良好。

3.4 準(zhǔn)確度測試

圖6 片劑中N-亞硝基-比索洛爾準(zhǔn)確度疊加圖

表4 富馬酸比索洛爾片準(zhǔn)確度（N-亞硝基-比索洛爾）

水平	已有量（ng）	加入量（ng）	測得量（ng）	回收率（%）	平均值（%）
100%	0.00	723.135	728.303	100.715	99.38
100%	0.00		739.090	102.206
100%	0.00		799.763	110.597
100%	0.00		662.237	91.579
100%	0.00		708.528	97.980
100%	0.00		673.922	93.195

說明：6份樣品中N-亞硝基-比索洛爾的回收率在91.58~110.60%，平均回收率為99.38%，本方法檢測準(zhǔn)確度良好。

3.5 檢測限測試

圖7 N-亞硝基-比索洛爾濃度為30ng/mL對照品測試譜圖

表5 N-亞硝基-比索洛爾濃度為30ng/mL對照品測試數(shù)據(jù)

名稱	保留時間(min)	峰面積(mAU*s)	信噪比
N-亞硝基-比索洛爾	13.973	3.023	30.324

說明：根據(jù)上表N-亞硝基-比索洛爾濃度為30ng/mL對照品測測試數(shù)據(jù)，3倍信噪比為檢出限計(jì)算可知N-亞硝基-比索洛爾檢測限理論結(jié)果為2.9679ng/mL。

3.6 某廠家片劑測試

圖8 某廠家片劑測試譜圖

說明：某廠家片劑中未檢測出N-亞硝基-比索洛爾。

4．結(jié)論

根據(jù)FDA日前發(fā)布的藥物基質(zhì)亞硝胺雜質(zhì)（NDSRI，Nitrosamine Drug Substance-Related Impurities）允許攝入量設(shè)定的指南文件對富馬酸比索洛爾片中亞硝胺雜質(zhì)N-亞硝基-比索洛爾進(jìn)行研究。根據(jù)該文件計(jì)算AI（允許攝入量，Acceptable Intake）值均為1500ng/天，同時結(jié)合本品最大日劑量（10mg），在片劑中的控制限度為不得過150ppm。采用皖儀科技高效液相色譜儀LC3400系列配置紫外檢測器進(jìn)行相應(yīng)的方法學(xué)驗(yàn)證。用已驗(yàn)證的檢測方法對富馬酸比索洛爾片樣品進(jìn)行檢測，未檢出亞硝胺雜質(zhì)N-亞硝基-比索洛爾。以上數(shù)據(jù)均滿足藥典方法對于儀器的要求。